本试验通过已经建立的川省测荧光PCR方法，对四川部分地区自然环境中的重点中虫包虫虫卵进行检测，采集包虫流行地区石渠县、包虫病流色达县、行区甘孜县、土壤炉霍县、环境天全县和宝兴县的卵污环境样本，提取样本总DNA，染情采用荧光PCR对细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫ND1基因进行检测；结果显示，况监共采集犬粪850份，川省测阳性82份，重点中虫阳性率12. 4%；土壤61份，包虫病流阳性8份，行区阳性率13. 1%；犬毛39份，土壤阳性3份，环境阳性率7. 7%；水样80份，均未检出。本次调查显示，犬粪、土壤以及犬毛均检出包虫虫卵DNA，土壤是一个不可忽视的传播因素。提示有必要加强对环境中虫卵的监测并筛选杀灭环境中虫卵消毒剂，以确保包虫病流行区域人和家畜的安全。
细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫引发的棘球蚴病，统称包虫病，是一种严重的人兽共患寄生虫病，主要感染人、牛羊等家畜以及小型啮齿类动物。包虫病不仅严重危害居民健康，而且导致包虫病患者因病返贫，严重制约了当地社会经济的发展。四川、青海、宁夏、甘肃以及新疆等省是包虫病高发地区，其中四川省的甘孜州和阿坝州全州、雅安市的天全县和宝兴县以及凉山州的木里县和越西县均是包虫病流行区域。
人和动物感染包虫病主要是经口感染 (比如误食被包虫虫卵污染的水和食物，手接触了被虫卵污染的土壤或者犬的皮毛) ，虫卵经口进入胃，在宿主消化液作用下发育成六钩蚴经肠壁进入血液。中绦期的幼虫可在患者及动物体内像肿瘤样生长发育和侵润迁移，对肝脏等脏器损害严重。包虫的虫卵已在孕节内提前发育为六钩蚴，不需要在外界环境中发育，因此随粪便排出的虫卵已经完全发育成熟，对人和其他中间宿主均已具有感染力。除此之外，虫卵对低温抵抗力极强，能在外界环境中长期存活并保持感染力。细粒棘球绦虫虫卵-80℃至少需要7 d方能彻底灭活，而在7℃可存活200 d以上，21℃可存活50天。多房棘球绦虫虫卵在实验室4℃水中可存活16个月。在德国南部，秋冬季节可存活8个月，夏季可存活78 d，在潮湿土壤中也可存活很长时间。
本试验的目的是对本省包虫病流行地区自然环境中包虫虫卵污染情况进行初步调查，为进一步完善包虫病防控措施提供数据及技术支撑。
1 材料与方法
1.1 样本采集
共采集新鲜犬粪850份，其中：石渠县103份、炉霍县97份、甘孜县90份、天全县281份、宝兴县279份；土壤样本61份，取地表土层1 cm内的土壤，每份100 g左右，其中：石渠县A乡20份、石渠县B乡21份，炉霍县10份、色达县10份，所有土壤样本均采集于犬舍为中心100平米范围内；犬颈部毛发样本39份，其中石渠县A乡20份、石渠县B乡19份；公路旁地表水样本80份，其中石渠县A乡30份、石渠县B乡10份、石渠县C乡20份以及炉霍县20份，每份50 m L左右。由于犬粪是环境中虫卵的唯一来源，所以采集犬粪、犬舍周围土壤及犬毛过程中，必须做好安全防护，避免感染包虫虫卵。
1.2 主要试剂及仪器
Power SYBR Green PCR Master Mix，购自ABI公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；粪便及土壤样本彻底破碎采用Bertin Precellys 24组织破碎仪；样本总DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit；最终检测仪器为杭州博日9600型荧光PCR仪。
1.3 核酸的提取
所有样本的核酸提取均采用E.Z.N.A Stool DNA Kit试剂盒，按照说明书进行操作。其中，土壤及犬粪样本需用Bertin Precellys 24组织破碎仪充分破碎后再进行核酸提取；水体样本需至少13 000 r/min离心5 min后收集沉淀，再进行核酸提取；犬毛需在50 m L试管中，用超纯水充分震荡洗涤后，13 000 r/min离心5 min后收集沉淀，提取核酸。所有样本最后洗脱的总DNA于-20℃保存备用。
1.4 检测方法
通过生物信息学对细粒棘球绦虫G1，G6和G7株及多房棘球绦虫大量序列进行比对分析，选取线粒体上ND1基因作为检测基因，产物长度为98 bp，所用引物序列及反应体系均采用先前本实验室建立的方法[7]。PCR体系为50μL，上下游引物终浓度分别为0.3μmol/L，模板1-3μL (约为5 ng) 。反应条件为预变性：94℃5 min；变性94℃30s，60℃退火及延伸30 s，共40个循环，按照仪器默认设置添加熔解曲线分析步骤。其中阳性对照细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫阳性DNA均由本实验保存。
2 结果
2.1 检测结果
所有样本检测结果如表1所示，犬粪样本：石渠县、炉霍县、甘孜县、天全县和宝兴县包虫阳性率分别为3.9%、38.1%、27.8%、100%、6.1%和8.2%，总阳性率为12.4%；土壤样本：石渠县A乡、石渠县B乡、炉霍县和色达县阳性率分别为15.0%、14.3%、20.0%和0，总阳性率为13.1%；犬毛样本：石渠县A乡和石渠县B乡阳性率分别为10.0%和5.3%，总阳性率为7.7%；所有水体样本均为阴性。
2.2 PCR产物的特异性
通过熔解曲线分析，所有阳性样本的熔解峰均与阳性对照吻合，且均为单峰，说明整个PCR反应特异性好，产物均为目的基因产物，无非特异性产物。
3 讨论
四川省甘孜州和阿坝州全州、雅安市的宝兴县和天全县、凉山州的木里县和越西县是包虫病流行区域，其中甘孜州、阿坝州的部分地区属于重度流行区。尤其是甘孜州的石渠县，是全世界包虫病研究中心，同时也是最严重的地区，而宝兴县、天全县、木里县和越西县均属于轻度流行区。
犬粪便中的虫卵是感染人和动物的唯一阶段，感染途径主要是犬粪污染环境，包括土壤、水源以及犬体表的被毛等，人和动物通过直接接触犬粪以及上述被犬粪污染的环境，经口摄入虫卵导致感染。由于包虫虫卵已在体内发育成熟，排出犬体外就已经具有感染性，而且对低温具有很强抵抗力，所以一旦犬粪污染周围环境，很容易造成人和动物感染包虫。造成犬粪污染环境主要有以下因素：
(1) 当地居民对包虫病认识及重视程度低，犬只不经常拴养，导致犬粪污染居住地周边环境
(2) 夏季牧场时期，犬只需保护家畜免遭狼、狐狸捕食，必须自由活动，无法拴养
(3) 当地居民对犬粪无法进行有效处理：高原地区地广人稀，居住分散，很难做到犬粪的统一回收、消毒和处理，因此犬粪长时间暴露于外界环境中。
据报道，在波兰，从当地种植的蔬菜表面、野生蘑菇及土壤中均检测出了多房棘球绦虫虫卵DNA。犬粪中的虫卵粘附于犬被毛，也是造成人感染的一个重要途径。川西北地区的甘孜州和阿坝州大部分地区犬只数量众多，以甘孜州石渠县为例，目前登记在册的犬只大约2万只左右，家家养犬，人与犬接触频繁，尤其是儿童，在与犬接触玩耍后未能马上洗手，很容易将犬体表被毛上的虫卵摄入口中，造成感染。2017年9月本人在石渠县德荣玛乡调查时发现，就有6~12岁儿童感染包虫的病例。另据报道，在哈萨克斯坦，1988-1995年期间，包虫发病率在1.4人/10万，但从1997-2000年增长到了3.5~8.3人/10万，其中29%的患者是年龄14岁以下的儿童。犬粪也可能污染地表水源，但在本研究中所有水体样本均未检出包虫虫卵，原因可能是水源中即使被污染虫卵，数量也很少，加之每份样本量只有50 m L，很难富集到虫卵。因此，对地表水源中虫卵的检测可能需要设计专门的过滤装置，前期对大量水体进行过滤，富集虫卵，才有可能检出。本试验中采用的荧光PCR方法，特异性强，灵敏度高，能够同时检出细粒和多房棘球绦虫，尤其适合复杂样本 (犬粪、土壤) 中目的基因的检测，而且对ELISA阴性/阳性样本复核率高，不存在漏检和假阳性，非常适合后期环境中虫卵的持续监测。
寄生虫虫卵普遍具有坚固的外壳，除对外界不良环境有较强的适应性外，还对常规的消毒剂具有很强的抵抗力，如柔嫩艾美耳球虫的卵囊在次氯酸钠溶液中浸泡0.5 h，对其活力及感染性无明显影响。由于包虫虫卵污染的均为自然环境，如土壤、草地、犬的被毛等，存在大量易与消毒剂发生反应的有机物，导致消毒效果大大降低，无法达到杀灭虫卵的效果。因此，后期迫切需要筛选合适的消毒剂，用于高原地区环境中虫卵的杀灭，以确保人和家畜的安全，提高当地公共卫生水平。
综上所述，本研究在犬粪、土壤及犬毛样本中均检出了包虫虫卵DNA，说明当地居民部分程度上存在从环境中感染包虫的风险。我国从2015年开始，投入大笔专项资金，全面开展包虫病防控工作，包括犬只管理与驱虫、牛羊免疫、草原鼠害治理以及包虫病宣传教育等措施，取得了显著效果。在此基础上，如能进一步开展环境中包虫虫卵的持续监测，将为进一步降低人和动物感染包虫风险，以及完善包虫病防控体系提供数据支撑和技术支持。
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